Antibakterielle Wirkung von Weinen auf E.coli und S.typhimurium im Vergleich zur Wirkung zugesetzter Sulfite

Abstract

In der Oenologie wird allgemein vermutet, dass die antibakterielle Wirkung von Wein hauptsächlich im Zusammenspiel von verschiedenen Inhaltstoffen wie Alkohol, niedriger pH-Wert, phenolische Inhaltstoffe und organischen Säuren zu suchen ist. In der vorliegenden Arbeit wurde nun zusätzlich die antibakterielle Wirkung von Sulfiten, die nahezu allen Weinen als Hilfsstoff zur Konservierung zugegeben wird, untersucht. Hierzu wurden konventionell hergestellte, geschwefelte und unbehandelte, nicht geschwefelte Weine und Schwefel als Einzelfaktor in Kochsalzlösung miteinander verglichen. Die Versuche wurden mit den humanpathogenen Keimen Escherichia coli und Salmonella typhimurium im Auszählverfahren durchgeführt.

Bei Wein mit verschiedenen Schwefelungsstufen (10, 20, 30 und 50 mg Kaliumdisulfit) zeigte sich bereits nach 10 Minuten Einwirkzeit der Bakterien ein massives antibakterielles Potential. Nach 30 und 60 Minuten Einwirkzeit neigte sicht das bakterielle Wachstum gegen Null. Diese Wachstumshemmung wurde sowohl bei geschwefeltem wie auch ungeschwefeltem Wein beobachtet und gilt für E. coli und S. typhimurium gleichermaßen. Für die antibakterielle Wirkung des Weines in den ersten 30min nach der Schwefelzugabe spielte die Schwefelung also keine Rolle.

Der gleiche Versuch wurde mit stufenweise geschwefelter isotonischer Kochsalzlösung durchgeführt. Es wurde beobachtet, dass sich der gleiche antibakterielle Effekt wie bei Wein einstellt, dieser aber zeitverzögert nach 60min auftritt. Es bestand ein hoch signifikanter, negativ exponentieller Zusammenhang zwischen dem Schwefelgehalt und den gezählten Kolonien.

Mit der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass Schwefel im Vergleich zu Wein zeitverzögert antibakteriell wirkt, mit der Effektivität von Wein als antibakterielles Medium aber nicht mithalten kann. Die Schwefelung eines Weines erhöht die antibakterielle Wirkung von Wein also nicht.

1. Einleitung

Die antibakterielle Wirkung von Wein ist allgemein bekannt (Boban et al. 2010, Chan 2002, Daglia et al. 2007, Daroch et al. 2001, Herald & Davidson 1983, Marimon et al. 1998, Moretro & Daeschel 2004, Papadopoulou et al. 2005, Radovanovic et al. 2009, Vaquero et al. 2007, Waite & Daeschel 2007, Wen et al. 2003). Über die genauen Inhaltstoffe, die den antibakteriellen Effekt erzeugen, gibt es jedoch kontroverse Meinungen. Bisher wurde Schwefel als antibakterieller Hauptfaktor nicht in Betracht gezogen.

In der Studie von Waite und Daeschel (2007) wurden 4 Weinparameter auf antimikrobielle Aktivität untersucht. In Versuchen stellte sich beim Vergleich von pH, Säuregehalt, Schwefeldioxid und Ethanol heraus, dass der pH-Wert der wichtigste Faktor für die Inhibierung von Bakterien ist.

Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen gibt es eine Reihe weiterer Studien, die die Wichtigkeit des synergistischen Wirkens von pH, organischen Säuren und Ethanol untermauern (Marimon et al. 1998, Moretro & Daeschel 2004). Eine besondere Rolle wird in vielen Fällen den Phenolen zugeschrieben (Radovanovic et al.2009, Vaquero et al. 2007, Papadopoulou et al. 2005, Herald & Davidson 1983, Wen et al. 2003). Weiters gibt es Publikationen in welchen Resveratrol als das wichtigste Phenol zur bakteriellen Hemmung bezeichnet wird (Daroch et al. 2001, Chan 2002). Boban et al., (2010) wiederum zeigt, dass Resveratrolwerte nicht mit der beobachteten mikrobiellen Hemmung einhergehen. Diese Studie betont, dass die antimikrobielle Wirkung von Wein nicht auf einen Einzelbestandteil zurückgeführt werden kann.

In Boban et al. (2010) wird die antibakterielle Wirkung der Inhaltsstoffe wie folgt beschrieben: intakter Wein > phenolreduzierter Wein > dealkoholisierter Wein > Kombination von Ethanol und niedrigem pH Wert > niedriger pH > Ethanol. Separate Anwendung von Ethanol und niedrigem pH führt zu einem vernachlässigbaren antimikrobiellem Effekt, obwohl diese beiden Faktoren in Kombination synergistisch wirken. Die antimikrobielle Aktivität kann nicht auf einen Faktor zurückgeführt werden, vielmehr ist laut dieser Studie die Kombination aus niedrigem pH, Ethanol, Phenolen und weiteren Inhaltsstoffen am wirksamsten.

Durch die Fähigkeit von Schwefeldioxid (SO₂) die Aktivität von Mikroorganismen im Wein einzudämmen, liegt es nahe, dass SO₂ auch auf humanpathogene Bakterien hemmend wirkt, deren Aktivität einschränkt und damit als Einzelfaktor zur antibakteriellen Wirkung von Wein beiträgt.

Nach Troost (1988) hat das Schwefeln eines Weines zweierlei Hauptaufgaben, (1) enzymatische und chemische Oxidation wird eingedämmt und stabilisiert den Wein, (2) das Wachstum weinschädlicher Organismen wird gestoppt. Durch den Einfluss von Sauerstoff während der Weinherstellung werden bei enzymatischer als auch chemischer Oxidation viele unterschiedliche Reaktionsprodukte gebildet. Starke Oxidationsprozesse führen im Wein zu unerwünschten Verfärbungen und Fehltönen, die die Qualität des Weins dramatisch verschlechtern. Schwefeldioxid-Spezies sind für die Entgiftung von H2O2 und die Reduktion von Chinonen zu Phenolen sehr wichtig. Um die RedOx-Reaktionen zu stabilisieren und die oxidative Wirkung von Sauerstoff abzupuffern wird dem Wein Schwefeldioxid zugegeben. (du Troit, 2006)

Kolloidaler Schwefel als Arznei wurde erstmals 1888 von Debus in einer Publikation erwähnt. Erst 1934 gab es Versuche, die sich gezielt mit der antibakteriellen Wirkung auf humanpathogene Keime beschäftigten. Die Aufnahme von Schwefel in Form des Bisulfit-Anions (HSO3-) in eine Zelle erfolgt über einen Carrier-unterstützten Protonensymport (Park & Bakalinsky, 2004). In der Zelle liegt Schwefeldioxid in Form des Bisulfit-Anions (HSO3-) weiter vor und inhibiert das mikrobielle Wachstum durch die Störung von zentralen, grundlegenden, metabolischen Prozessen. HSO3- ist ein hochreaktives Molekül, das sämtliche Enzyme einer Zelle angreift. Somit sind beispielsweise Proteinsynthese, Atmungskette oder Glykolyse stark betroffen, was zu weniger ATP und NADH+H+ in der Zelle führt und die Zelle schwächt. Abgesehen von der Wirkung auf Enzyme verbindet sich HSO3- auch mit Metaboliten des Zellplasmas (Hinze & Holzer, 1986) und stört die Dynamik der Membransysteme der Zelle durch Bindung an spezifische Rezeptoren (Anacleto &van Uden, 1982).

Neben der Eindämmung von Fehlerquellen durch die Verringerung der chemischen und enzymatischen Oxidation sowie der antibakteriellen Wirkung wird SO₂ bei korrektem Einsatz auch geschmacksverbessernde Wirkung zugesprochen. Diese entsteht durch die Abbindung von Carbonylverbindungen wie Acetaldehyd oder Pyruvat.

Die antimikrobielle Wirkung von Wein auf Humanpathogene zeigt, dass Wein kein natürlicher Standort von Mikroorganismen ist. Bakteriengruppen und sonstige Mikroorganisemen, die trotzdem darin leben können, sind als Spezialisten aufzufassen. Zu ihrem Vermehrungspotenzial tragen vor allem die Säureverträglichkeit und die Alkoholtoleranz bei. Der Großteil der mikrobiellen Flora in Most besitzt diese Eigenschaften nicht und stirbt bereits während der Gärung. Ein kleiner Teil dieser Flora kann auf Grund der oben genannten Eigenschaften jedoch in Most und Wein bestehen, ist unter Umständen für mikrobielle Weinqualitätsminderungen verantwortlich und soll durch das Schwefeln des Weins abgetötet werden. Dazu zählen zum Beispiel Milchsäurebakterien, die im Falle des gewünschten Apfelsäureabbaus „nützlich“ sind und Apfelsäure in weniger sauer schmeckende Milchsäure umsetzen. (Dittrich & Großmann, 2005)

2. Material und Methode

Für die Untersuchung der antibakteriellen Wirkung von Wein wurden zwei Bakterienarten herangezogen, Escherichia coli und Salmonella typhimurium. Für die Kultivierung von E. coli (ATCC 25922) wurde das Nährmedium TSA (Trypticase Soy Agar, Fa. Roth) verwendet, S. typhimurium wurde auf CASO (Casein Soja Pepton Agar, Fa. Roth) angezüchtet.

Die verwendeten Weine und Flüssigkeiten, die auf antibakterielle Wirkung untersucht wurden waren: Klosterneuburg ROT (konventioneller Rotwein), Klosterneuburg WEIß (konventioneller Weißwein), Delinat ROT (Domaine de Mythopia, Pinot Noir 2010, unfiltriert, unbehandelt, ohne SO₂), NaCl 0,9% (ohne SO₂, 10 mg SO₂, 20 mg SO₂ ,30 mg SO₂, 50 mg SO₂), unfiltriert ROT Blaufränkisch (Rotwein ohne SO₂, 10 mg SO₂, 20 mg SO₂ ,30 mg SO₂, 50 mg SO₂), unfiltriert WEIß Chardonnay (Weißwein(ohne SO₂, 10 mg SO₂, 20 mg SO₂ ,30 mg SO₂, 50 mg SO₂).

Schwefel wurde in Form von Kaliumdisulfit (Kaliumpyrosulfit, Feikes) den Lösungen NaCl, unfiltriert ROT und unfiltriert WEIß zugegeben. Die Versuchslösungen „unfiltriert ROT und unfiltriert WEIß“ wurden selbst durch Vergärung von pasteurisiertem Most (Blaufränkisch und Chardonnay) hergestellt.

Um die Hemmung von Bakterien durch Wein zu untersuchen wurde das Auszählverfahren angewendet. Bei dieser Methode wird eine bestimmte Menge mit definierter Konzentration an Bakterien (100µL mit etwa 0,014 Trübe, Nano Drop 2000c Spektrophotometer, Firma Thermo Scientific) in eine bestimmte Menge Medium (5mL Klosterneuburg ROT, Klosterneuburg WEIß, Delinat ROT, NaCl mit Schwefelstufen, unfiltriert ROT mit Schwefelstufen, unfiltriert WEIß mit Schwefelstufen) pipettiert. Nach 10, 30 und 60 Minuten wurde 100 µL Medium auf die Platten pipettiert und mit einem Spatel verteilt. Die statistischen Berechnungen erfolgten mit SPSS.

3. Ergebnisse und Diskussion

Bei beiden getesteten Bakterien (S. typhimurium + E. coli) fällt im Gesamtvergleich der Flüssigkeiten nach 10 Minuten Einwirkzeit auf, dass bakterielles Wachstum nur bei NaCl – Lösungen mit und ohne Schwefel stattfindet (Abb. 1+4 - alle Abbildungen finden Sie im verlinkte pdf-Dokument). Die Ausnahme stellt hier das Bakterium S. typhimurium dar, das nach 10 Minuten Einwirkzeit bei unfiltriert ROT mit 50 mg Schwefel noch Wachstum zeigt, das sich aber bei 30 und 60 Minuten gegen Null einstellt.

Der Vergleich zeigt, dass die verschiedenen Weine ein hohes antibakterielles Potential auf die beiden untersuchten Pathogene aufweisen. Dabei ist es egal, ob die Weine geschwefelt oder ungeschwefelt sind. Beide Versuchsansätze (mit Schwefel und ohne Schwefel) wirken gleichermaßen hemmend auf S. typhimurium und E. coli.

Bei NaCl – Lösungen mit Schwefelstufen nimmt die Anzahl der Kolonien, die nach 10 Minuten gezählt wurden, bei E. coli mit dem Schwefelgehalt leicht, aber doch signifikant, zu (Abb. 9). Im Fall von Escherichia coli dürfte eine kurzzeitige Zugabe an Schwefel die Zellteilungsrate positiv beeinflussen, sodass mehr Kolonien ausgezählt wurden. Bei S. typhimurium gibt es zwischen den Schwefelstufen nach 10 Minuten Einwirkzeit keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl der Kolonien (Abb. 7).

Lässt man S. typhimurium und E. coli 30 Minuten lang in NaCl ohne Schwefel, mit 10 mg Schwefel, mit 20 mg Schwefel, mit 30 mg Schwefel und mit 50 mg Schwefel einwirken, stellt sich bei beiden Bakterien ein hoch signifikanter Zusammenhang zwischen dem Schwefelgehalt und der Anzahl der Kolonien ein (Abb. 8+10). Das heißt, dass die Anzahl der Kolonien mit steigendem Schwefelgehalt sinkt, weil Schwefelverbindungen die sich in der NaCl – Lösung bilden, das bakterielle Wachstum hemmen.

Nach 60 Minuten Einwirkzeit konnte kein statistischer Zusammenhang zwischen den Schwefelstufen erstellt werden, weil das bakterielle Wachstum bei allen NaCl – Lösungen mit Schwefelzugabe gegen Null gehemmt wurde; nur die Lösung „NaCl ohne Schwefel“ lässt bei 10, 30 und 60 Minuten bakterielles Wachstum zu und es konnten Kolonien gezählt werden.

Die Schwefelabstufungen in den NaCl – Lösungen lassen wichtige Schlüsse zu: Bei kurzer Anwendung von Schwefel in NaCl kommt es zu einer Steigerung der bakteriellen Aktivität bei Escherichia coli. Dauert die Schwefelexposition länger (30 und 60 Minuten), stellt sich bei beiden Bakterien ein hoch signifikanter Hemmungseffekt ein. Bei den Aufschlüsselungen der Schwefelstufen nach der Einwirkzeit wird deutlich, dass bei jeder NaCl – Lösung mit Schwefelzugabe ein hoch signifikanter, linearer Zusammenhang zwischen der Einwirkzeit und der Anzahl der Kolonien besteht. Das bedeutet, dass Schwefel bei ausreichender Einwirkdauer eine ähnliche antibakterielle Wirksamkeit wie Wein besitzt (S. typhimurium: Abb. 1-3; E. coli: Abb. 4-6).

4. Konklusion

Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass Schwefeldioxid zwar nach 60 Minuten antibakteriell wirkt, mit der antibakteriellen Effizienz von Wein aber nicht mithalten kann; die antibakterielle Wirkung von Schwefeldioxid in Kombination mit Wein wird von den antibakteriellen Wirkstoffen im Wein übertönt. Eine vermehrte Zugabe von Schwefeldioxid in Wein steigert den antibakteriellen Effekt von Wein nicht, da die komplexe antimikrobielle Wirkung des Weines bereits zu einen vollständigen Hemmung des Bakterienwachstums von E.coli und S. typhimurium führt.

Die antibakterielle Wirkung von Wein lässt sich nicht durch die Schwefelung des Weines erklären. Weitere mögliche Wirkungsmechanismen wie Phenolgehalt, Säuregehalt und mikrobielle Besiedelung werden derzeit in einem weiterführenden Gemeinschaftsprojekts des Bundesamt für Obst und Wein in Klosterneuburg und dem Delinat-Institut untersuchtet.

5. Dank

Die Laboratorien wurden vom Bundesamt für Obst- und Weinbau, Wiener Straße 74, A-3400 Klosterneuburg zur Verfügung gestellt. Wir danken der Domaine de Mythopia für die Zurverfügungstellung der ungeschwefelten Naturweine.

6. Literaturverzeichnis